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烧伤代谢和营养及免疫调控
ω-3多不饱和脂肪酸对严重烧伤大鼠早期肠黏膜损伤的影响及其机制
中华烧伤杂志, 2017,33(08): 476-480. DOI: 10.3760/cma.j.issn.1009-2587.2017.08.004
摘要
目的

观察ω-3多不饱和脂肪酸(PUFA)对严重烧伤大鼠早期肠黏膜损伤的影响,并探讨其机制。

方法

取120只SD大鼠,按随机数字表法分为假伤组、单纯烧伤组和ω-3 PUFA组,每组40只。假伤组大鼠仅模拟烫伤过程。单纯烧伤组和ω-3 PUFA组大鼠背部造成30%TBSA Ⅲ度烫伤(下称烧伤)。伤后5 min,假伤组和单纯烧伤组大鼠按1 mL/kg经尾静脉注射生理盐水,ω-3 PUFA组大鼠通过同样的方式按1 mL/kg注射ω-3 PUFA溶液。伤后3、6、12、24、48 h,3组分别取8只大鼠,收集腹主动脉血及肠黏膜,分光光度法检测血清二胺氧化酶(DAO)含量,ELISA法检测血清TNF-α、IL-6含量,蛋白质印迹法检测肠黏膜NF-κB-p65蛋白表达。对数据行析因设计方差分析、单因素方差分析、χ2检验、LSD检验及Bonferroni校正。

结果

(1)伤后各时相点,单纯烧伤组与ω-3 PUFA组大鼠血清DAO含量明显高于假伤组(P值均小于0.01),ω-3 PUFA组大鼠血清DAO含量明显低于单纯烧伤组(P值均小于0.01)。(2)单纯烧伤组与ω-3 PUFA组大鼠伤后各时相点血清TNF-α、IL-6含量均明显高于假伤组(P值均小于0.01),ω-3 PUFA组大鼠伤后各时相点血清TNF-α、IL-6含量均明显低于单纯烧伤组(P值均小于0.01)。(3)单纯烧伤组与ω-3 PUFA组大鼠伤后各时相点肠黏膜NF-κB-p65蛋白表达量明显高于假伤组(P值均小于0.01)。伤后3、6、12、24、48 h,ω-3 PUFA组大鼠肠黏膜NF-κB-p65蛋白表达量分别为1.398±0.016、1.999±0.948、2.803±0.065、1.739±0.602、1.484±0.645,明显低于单纯烧伤组的2.096±0.113、3.402±0.189、4.183±0.558、3.618±0.408、2.614±0.775,P值均小于0.01。

结论

ω-3 PUFA可能是通过降低烧伤后肠黏膜NF-κB-p65蛋白表达及血清DAO、TNF-α、IL-6含量,抑制机体炎症反应,从而减轻严重烧伤大鼠肠黏膜损伤。

引用本文: 蔡晨, 夏正国, 徐庆连, 等.  ω-3多不饱和脂肪酸对严重烧伤大鼠早期肠黏膜损伤的影响及其机制 [J]. 中华烧伤杂志,2017,33( 8 ): 476-480. DOI: 10.3760/cma.j.issn.1009-2587.2017.08.004
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严重烧伤后,机体大量体液丢失,引发低血容量性休克及缺血再灌注损伤,常导致肠黏膜通透性增加及细菌/LPS移位[1],最终引发肠源性感染,大量TNF-α、IL-6等炎症介质的释放。这些炎症介质在机体SIRS中起着始动与调控作用,是烧伤后脓毒症和MODS发生、发展的中心环节。因此,如何减轻烧伤患者肠黏膜的损伤是预防SIRS向MODS发展的关键。二胺氧化酶(DAO)主要存在于小肠黏膜绒毛,血清DAO含量是反映小肠黏膜结构和功能较理想的指标。降低脓毒症大鼠肠组织NF-κB-p65蛋白表达和血清TNF-α、IL-6等含量,可显著减轻脓毒症大鼠肠黏膜损伤[2]。ω-3多不饱和脂肪酸(PUFA)具有免疫调节功能及缓解急慢性炎症的作用,还可降低ICU严重烧伤患者脓毒症和感染性休克的发生率[3]。本研究肠外给予严重烫伤大鼠ω-3 PUFA,监测其对血清中DAO及炎症因子TNF-α、IL-6含量,以及肠黏膜组织NF-κB-p65蛋白表达的影响,探讨ω-3 PUFA对烧伤后大鼠肠黏膜损伤的作用及其可能机制。

1 材料与方法
1.1 动物及主要试剂与仪器来源

120只健康清洁级SD大鼠,8~10周龄,体质量200~250 g,雌雄各半,由安徽医科大学动物实验中心提供,许可证号:SCXK(皖)2014-004。ω-3 PUFA溶液购自华瑞制药有限公司,组织细胞裂解液购自美国Sigma公司,二辛丁酸(BCA)试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司,TNF-α、IL-6 ELISA检测试剂盒和DAO活性比色法定量检测试剂盒购自南京建成生物科技有限公司,兔抗大鼠NF-κB-p65单克隆一抗购自美国Cell Signaling Technology公司,辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司,β肌动蛋白购自美国Santa Cruz公司。UV-3010型紫外-可见光分光光度计购自日本日立公司,Biofuge 22R型台式低温高速离心机购自德国Heraeus公司,Odyssey型凝胶图像分析系统购自美国LI-COR公司。

1.2 动物分组及处理

大鼠适应性饲养1周后,按随机数字表法分为假伤组、单纯烧伤组和ω-3 PUFA组,每组40只。大鼠实验前禁食12 h、自由饮水。所有大鼠均腹腔注射100 g/L水合氯醛(3 mL/kg)麻醉,背部去毛。假伤组大鼠背部置于20 ℃温水中12 s模拟致假伤;单纯烧伤组和ω-3 PUFA组大鼠背部置于98 ℃热水中15 s,造成30%TBSA Ⅲ度烫伤(下称烧伤),伤后即刻腹腔注射乳酸林格液4 mL·kg-1·%TBSA-1抗休克。伤后5 min,假伤组和单纯烧伤组大鼠按1 mL/kg经尾静脉注射生理盐水,ω-3 PUFA组大鼠按1 mL/kg经尾静脉注射ω-3 PUFA溶液[4]

1.3 标本采集

伤后3、6、12、24、48 h,每组各取8只大鼠,在无菌条件下,每只大鼠取5~6 mL腹主动脉血,于4 ℃冰箱中保存2 h。以离心半径6 cm,4 000 r/min离心15 min,取上清液,于-20 ℃低温冰箱中保存。各组大鼠各时相点取血后即刻处死,取肠黏膜组织,0 ℃生理盐水冲洗肠内容物,-80 ℃保存。

1.4 检测指标
1.4.1 血清DAO含量

伤后各时相点,3组大鼠各取200 μL冻融血清,用紫外分光光度计于480 nm波长处检测血清DAO吸光度值,计算DAO含量。

1.4.2 血清TNF-α、IL-6含量

伤后各时相点,3组大鼠各取200 μL冻融血清,ELISA法测定血清中TNF-α和IL-6的含量,操作严格按ELISA检测试剂盒说明书进行。

1.4.3 肠黏膜NF-κB-p65蛋白表达

采用蛋白质印迹法检测,以β肌动蛋白为内参照。伤后各时相点,3组各取保存的肠黏膜组织50 mg,加入组织细胞裂解液,充分研磨,提取总蛋白,使用BCA试剂盒进行蛋白定量。取20 μg蛋白,行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电脉,半干法转膜,50 g/L脱脂奶粉溶液室温封闭2 h。加入兔抗大鼠NF-κB-p65单克隆一抗(稀释比为1∶1 000),4 ℃孵育过夜。加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗(稀释比为1∶5 000),化学发光、显影,凝胶图像分析系统行蛋白条带灰度扫描分析。NF-κB-p65蛋白的表达以NF-κB-p65蛋白灰度值与β肌动蛋白灰度值比值表示。本实验重复3次。

1.5 统计学处理

数据以±s表示,采用SPSS 16.0统计软件行析因设计方差分析、单因素方差分析、LSD检验(软件自动略去该统计量值)及Bonferroni校正,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果
2.1 血清DAO含量

伤后各时相点,单纯烧伤组和ω-3 PUFA组大鼠的血清DAO含量明显高于假伤组(P值均小于0.01),ω-3 PUFA组大鼠血清DAO含量明显低于单纯烧伤组(P值均小于0.01)。见表1

表1

假伤组和烫伤各组大鼠各时相点血清二胺氧化酶含量比较(U/mL,±s)

表1

假伤组和烫伤各组大鼠各时相点血清二胺氧化酶含量比较(U/mL,±s)

组别鼠数(只)伤后3 h伤后6 h伤后12 h伤后24 h伤后48 h
假伤组400.326±0.0300.388±0.0200.443±0.0150.412±0.0140.405±0.014
单纯烧伤组400.591±0.027a0.836±0.046a1.322±0.035a1.150±0.058a0.994±0.051a
ω-3 PUFA组400.550±0.033ab0.710±0.033ab1.119±0.073ab0.873±0.043ab0.676±0.037ab
F 178.493358.279750.808616.100503.867
P <0.01<0.01<0.01<0.01<0.01

注:PUFA为多不饱和脂肪酸;处理因素主效应,F=2 345.885,P<0.01;时间因素主效应,F=503.078,P<0.01;两者交互作用,F=91.600,P<0.01;与假伤组比较,aP<0.01;与单纯烧伤组比较,bP<0.01

2.2 血清TNF-α、IL-6含量

伤后各时相点,单纯烧伤组和ω-3 PUFA组大鼠血清TNF-α、IL-6含量均明显高于假伤组(P值均小于0.01),ω-3 PUFA组大鼠血清TNF-α、IL-6含量明显低于单纯烧伤组(P值均小于0.01)。见表2

表2

假伤组和烫伤各组大鼠各时相点血清TNF-α与IL-6含量比较(pg/mL,±s)

表2

假伤组和烫伤各组大鼠各时相点血清TNF-α与IL-6含量比较(pg/mL,±s)

组别与指标鼠数(只)伤后3 h伤后6 h伤后12 h伤后24 h伤后48 h
假伤组40     
 TNF-α 59.7±1.760.6±1.372.3±2.068.6±1.664.2±2.0
 IL-6 68.5±2.370.8±1.776.6±1.473.7±0.872.1±1.5
单纯烧伤组40     
 TNF-α 140.5±4.9a253.2±30.7a339.7±4.3a249.3±3.3a195.3±5.3a
 IL-6 142.1±4.1a192.8±5.4a277.3±5.2a224.4±5.6a170.3±4.5a
ω-3 PUFA组40     
 TNF-α 99.2±4.9ab178.8±4.3ab229.4±6.7ab203.4±6.0ab132.2±5.7ab
 IL-6 103.8±4.2ab137.4±3.7ab206.5±6.5ab167.8±4.9ab147.5±3.7ab
F1 761.358235.2896 356.8664 234.7581 599.289
P1 <0.01<0.01<0.01<0.01<0.01
F2 817.8631 973.1163 479.6532 478.0951 773.187
P2 <0.01<0.01<0.01<0.01<0.01

注:PUFA为多不饱和脂肪酸;TNF-α处理因素主效应,F=3 700.989,P<0.01;时间因素主效应,F=566.538,P<0.01;两者交互作用,F=133.969,P<0.01; IL-6处理因素主效应,F=10 250.673,P<0.01;时间因素主效应,F=1 368.681,P<0.01;两者交互作用,F=320.042,P<0.01;F1值、P1值,F2值、P2值分别为组间TNF-α、IL-6各时相点总体比较所得;与假伤组比较,aP<0.01;与单纯烧伤组比较,bP<0.01

2.3 肠黏膜NF-κB-p65蛋白表达

单纯烧伤组和ω-3 PUFA组大鼠伤后各时相点肠黏膜NF-κB-p65蛋白表达量明显高于假伤组(P值均小于0.01),ω-3 PUFA组大鼠伤后各时相点肠黏膜NF-κB-p65蛋白表达量明显低于单纯烧伤组(P值均小于0.01)。见表3图1

表3

假伤组和烫伤各组大鼠各时相点肠黏膜NF-κB-p65蛋白表达比较(±s)

表3

假伤组和烫伤各组大鼠各时相点肠黏膜NF-κB-p65蛋白表达比较(±s)

组别鼠数(只)伤后3 h伤后6 h伤后12 h伤后24 h伤后48 h
假伤组400.386±0.0210.408±0.0130.442±0.0080.423±0.0130.419±0.186
单纯烧伤组402.096±0.113a3.402±0.189a4.183±0.558a3.618±0.408a2.614±0.775a
ω-3 PUFA组401.398±0.016ab1.999±0.948ab2.803±0.065ab1.739±0.602ab1.484±0.645ab
F 1 320.2945 670.46311 668.54711 341.1631 764.725
P <0.01<0.01<0.01<0.01<0.01

注:PUFA为多不饱和脂肪酸;处理因素主效应,F=23 306.569,P<0.01;时间因素主效应,F=1 839.879,P<0.01;两者交互作用,F=601.798,P<0.01;与假伤组比较,aP<0.01;与单纯烧伤组比较,bP<0.01

图1
蛋白质印迹法检测假伤组和烫伤各组大鼠伤后各时相点肠黏膜NF-κB-p65蛋白表达

注:1~3分别为假伤组、单纯烧伤组、ω-3多不饱和脂肪酸组,从上至下分别为伤后3、6、12、24、48 h

图1
蛋白质印迹法检测假伤组和烫伤各组大鼠伤后各时相点肠黏膜NF-κB-p65蛋白表达
3 讨论

肠道是机体内最大的免疫器官,在机体的免疫功能中具有重要作用。肠道内存在大量的细菌、LPS和其他有害物质,但在正常情况下,由于肠道屏障功能的存在,这些有害物质难以进入血液循环。严重烧伤后,机体有效循环血容量减少,肠黏膜极易发生缺血、缺氧性损伤,导致肠黏膜上皮细胞破坏,大量DAO进入血液,从而引起血液中DAO含量升高。ω-3 PUFA作为特定的免疫营养素,不仅可以为机体提供能量和代谢底物,还可以抑制机体的炎症反应、增强机体的免疫功能[5]。李兴照等[6]研究显示,大鼠烧伤后立即经尾静脉给予ω-3 PUFA溶液,可以有效降低其血清DAO含量。本研究中单纯烧伤组和ω-3 PUFA组大鼠伤后各时相点血清DAO含量明显高于假伤组,提示烧伤后大鼠肠黏膜损伤明显;ω-3 PUFA组大鼠伤后各时相点血清DAO含量明显低于单纯烧伤组,说明给予肠外ω-3 PUFA溶液可以降低烧伤大鼠血清DAO水平,减轻烧伤后大鼠肠黏膜的损伤,这与相关报道[7]一致。

严重烧伤后肠黏膜损伤,细菌、LPS移位,导致大量炎症介质、细胞因子的产生和释放,从而使炎症反应失控,导致SIRS,甚至MODS的发生。TNF-α是在烧/创伤和感染性休克中最早释放,起关键始动作用的细胞因子。IL-6是具有多功能的细胞因子,参与调节免疫反应及炎症反应,与SIRS的严重程度和致死率密切相关。NF-κB是一个转录因子蛋白家族,包括Rel (cRel)、p65 (RelA,NF-κB3)、RelB和p50(NF-κB1)、p52(NF-κB2)等5个亚单位,最常见的是p65与p50组成的异二聚体。在静息的细胞中,NF-κB和NF-κB的抑制蛋白(IκB)形成复合体,以无活性形式存在于细胞质中;当受细胞外信号刺激后,NF-κB和IκB形成的复合体被激活,诱导TNF-α、IL-6等炎性细胞因子的表达。大鼠严重烧伤后,LPS等可激活NF-κB和IκB形成的复合体,使TNF-α、IL-2、IL-6、IL-8、β干扰素等多种细胞因子的合成和释放增加。而NF-κB-p65蛋白的表达水平可间接反映其活性。研究显示,ω-3 PUFA可以降低烫伤大鼠损伤组织NF-κB的表达,减轻机体组织损伤[8]。ω-3 PUFA在体内代谢过程中产生一类新型脂质介质Resolvin,该介质具有抗炎和免疫调节活性。二十二碳六烯酸是ω-3 PUFA家族中的一员,章杰等[9]研究表明,大鼠烫伤后立即肠外给予二十二碳六烯酸,可以有效降低血清TNF-α、IL-6含量及肺组织NF-κB-p65的蛋白表达,减轻机体炎症反应,保护内脏器官。笔者课题组前期研究结果显示,大鼠烫伤后立即给予ω-3 PUFA溶液,可以降低其肠黏膜组织TNF-α mRNA的表达及血清TNF-α、IL-6含量,提示ω-3 PUFA可以降低烧伤后炎症介质水平,改善烧伤后肠黏膜损伤[6]。本研究显示,单纯烧伤组和ω-3 PUFA组伤后各时相点血清TNF-α、IL-6水平及肠黏膜组织NF-κB-p65蛋白表达水平显著高于假伤组;而ω-3 PUFA组血清TNF-α、IL-6水平和肠黏膜NF-κB-p65蛋白表达明显低于单纯烧伤组,表明ω-3 PUFA可以抑制肠黏膜NF-κB-p65蛋白的表达,降低血清TNF-α、IL-6水平,从而减轻机体炎症反应。

综上所述,肠外给予严重烧伤大鼠ω-3 PUFA,可以抑制肠黏膜组织NF-κB-p65蛋白的表达,降低血清DAO含量、减少TNF-α、IL-6等炎症介质的释放,从而减轻烧伤后肠黏膜损伤。本研究仍有许多不足之处,ω-3 PUFA仅在烧伤后5 min给予,需要在使用方法等方面进行进一步改善。有研究报道,来源于ω-3 PUFA的代谢产物Resolvin具有减轻烧伤大鼠肾脏和肝脏损伤的作用[10],可通过改善中性粒细胞功能,减轻烧伤感染和降低烧伤脓毒症的发生率[11],并具有预防烧伤创面继发性血栓形成及组织坏死的作用[12],笔者尚未对此进行深入研究。另外,笔者课题组将对ω-3 PUFA及其代谢产物Resolvin降低烧伤后肠黏膜组织NF-κB-p65蛋白表达的分子机制进行探讨,并考虑使用NF-κB-p65拮抗剂。

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关键词
主题词
烧伤
脂肪酸类,ω3
肠粘膜
NF-κB
炎症介质