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烧伤代谢和营养及免疫调控
重度烧伤小鼠脾脏凝溶胶蛋白含量和mRNA表达及T淋巴细胞增殖活性的变化
中华烧伤杂志, 2017,33(08): 481-485. DOI: 10.3760/cma.j.issn.1009-2587.2017.08.005
摘要
目的

研究重度烧伤小鼠脾脏凝溶胶蛋白(GSN)含量和mRNA表达及T淋巴细胞增殖活性的变化,选择GSN的最佳干预时间。

方法

取80只雄性BALB/c小鼠,按随机数字表法分为假伤组和烧伤组,每组40只。烧伤组小鼠造成背部15%TBSAⅢ度烫伤(下称烧伤),伤后即刻皮下注射生理盐水1 mL,背部涂适量碘伏防治感染,每日1次。假伤组小鼠致假伤,伤后不补液、不外涂碘伏。分别于伤后0(即刻)、8、24、48、72 h,每组各取8只小鼠,无菌留取脾脏,噻唑蓝比色法检测脾脏T淋巴细胞增殖活性,ELISA法检测脾脏组织中GSN含量,实时荧光定量RT-PCR法检测脾脏组织中GSN mRNA表达。对数据行析因设计方差分析、单因素方差分析、LSD检验及Bonferroni校正。

结果

(1)2组小鼠伤后0 h的脾脏T淋巴细胞增殖活性无明显差异(P>0.05),假伤组小鼠伤后8、24、48、72 h脾脏T淋巴细胞增殖活性显著高于烧伤组(P值均小于0.05)。假伤组小鼠伤后各时相点脾脏T淋巴细胞增殖活性无明显差异(F=0.756,P>0.05);烧伤组小鼠伤后8 h脾脏T淋巴细胞增殖活性为0.12±0.04,显著低于组内伤后0、24、48、72 h的0.73±0.07、0.56±0.07、0.51±0.09、0.59±0.07(P值均小于0.05)。(2)2组小鼠伤后0 h脾脏组织中GSN含量无明显差异(P>0.05),假伤组小鼠伤后8、24、48、72 h脾脏组织中GSN含量显著高于烧伤组(P值均小于0.05)。假伤组小鼠伤后各时相点脾脏组织中GSN含量无明显差异(F=1.083,P>0.05);烧伤组小鼠伤后8 h脾脏组织中GSN含量为(11.9±2.6)pg/mg,显著低于组内伤后0、24、48、72 h的(37.7±2.9)、(19.9±4.0)、(24.1±4.1)、(24.6±4.0)pg/mg(P值均小于0.05)。(3)2组小鼠伤后0 h脾脏组织中GSN mRNA表达量无明显差异(P>0.05),假伤组小鼠伤后8、24、48、72 h脾脏组织中GSN mRNA表达量显著高于烧伤组(P值均小于0.05)。假伤组小鼠伤后各时相点脾脏组织中GSN mRNA表达量无明显差异(F=0.413,P>0.05);烧伤组小鼠伤后8 h脾脏组织中GSN mRNA表达量为0.307±0.064,显著低于组内伤后0、24、48、72 h的0.944±0.023、0.625±0.091、0.744±0.104、0.821±0.072(P值均小于0.05)。

结论

重度烧伤可导致小鼠脾脏GSN含量及mRNA表达、T淋巴细胞增殖活性显著下降,且三者均是在伤后8 h降至最低,可选择伤后8 h之前作为重度烧伤后GSN的最佳干预时间。

引用本文: 陈琦, 杨红明. 重度烧伤小鼠脾脏凝溶胶蛋白含量和mRNA表达及T淋巴细胞增殖活性的变化 [J]. 中华烧伤杂志,2017,33( 8 ): 481-485. DOI: 10.3760/cma.j.issn.1009-2587.2017.08.005
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凝溶胶蛋白(GSN)是一种重要的肌动蛋白结合蛋白,通过对肌动蛋白丝的结合、切割和解聚等作用调控肌动蛋白的构建,并受钙离子浓度、细胞内pH值、磷脂酰肌醇等因素的调节,涉及多种复杂功能,包括肌动蛋白活力调节、细胞运动调控、细胞凋亡控制以及血小板的形成和活化等[1]。GSN参与了多种细胞的多种生物进程,与细胞凋亡、凝血、免疫、肿瘤及炎症等病理生理过程的发生发展密切相关[2]。早期对于GSN的功能研究主要涉及细胞凋亡及肿瘤等领域,其参与调控细胞凋亡的进程、使肿瘤细胞表达下调和加强细胞运动性等方面。近年来的动物实验和临床观察表明,GSN在烧/创伤、炎症等领域仍有广泛的研究前景,血浆GSN水平是外科危重症潜在的预后生物标志物,并可作为严重脓毒症早期诊断的依据之一[3]。且急危重症患者血浆GSN浓度的降低往往发生在其并发症出现之前,大量GSN消耗有助于延缓MODS的发生,血浆GSN水平可以用来预测烧伤患者的预后[4]。本研究在重度烧伤小鼠模型基础上,观察重度烧伤后小鼠脾脏GSN含量及mRNA表达随伤后时间的变化趋势是否与脾脏T淋巴细胞增殖活性有共同点,为重度烧伤后选择GSN干预的最佳时间提供依据。

1 材料与方法
1.1 动物及主要试剂与仪器来源

40只雄性健康清洁级BALB/c小鼠,6~8周龄,体质量20~22 g,购自军事医学科学院实验动物中心,动物许可证号:SCXK(军)2012-0004。RPMI 1640培养基、小鼠T淋巴细胞分离液购自福建省博特生物科技有限公司,噻唑蓝购自美国Sigma公司,Triton-异丙醇、Trizol试剂购自北京兰博利德商贸有限公司,小鼠GSN ELISA检测试剂盒、总RNA提取试剂盒、反转录试剂盒购自美国Promega公司,SYBR Green荧光定量试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。小鼠GAPDH、GSN引物由北京赛百盛基因技术有限公司合成。5410型二氧化碳培养箱购自美国Napco公司,CKX41型倒置显微镜购自日本Olympus公司,DUTM-800型紫外可见光分光光度计购自美国Beckman Coulter公司,LightCycler480型DNA热循环仪购自美国PerkinElmer公司,7500型荧光定量PCR仪购自美国Applied Biosystems公司,Spectra MR型多功能酶标仪购自美国Dynex公司。

1.2 动物分组及处理

按随机数字表法将小鼠分为假伤组40只和烧伤组40只。烧伤组小鼠常规饲养5 d后,腹腔注射速眠新Ⅱ注射液合剂+氯胺酮(比例为2∶1,每只0.03 g)麻醉后背部备皮,并禁食24 h。水浴锅水温100 ℃,上盖平面木制盖板1块,根据所需烫伤面积15%TBSA,在板中央处开相应大小的长方形空洞,洞口平面与锅内水平面相平。小鼠用乙醚麻醉后,将其背部放在水锅盖板中空处水面上,致背部Ⅲ度烫伤(下称烧伤),烫伤时间为8 s。烫伤后立即皮下注射生理盐水1 mL,背部涂适量碘伏防治感染,每日1次。伤后小鼠分笼常规饲养,观察小鼠呼吸、循环情况至麻醉苏醒。保暖24 h。假伤组小鼠烫伤水温为30 ℃,伤后不补液、不外涂碘伏,余处理同烧伤组小鼠。

1.3 标本采集与处理

分别于伤后0(即刻)、8、24、48、72 h,每组各取8只小鼠,断颈处死。立即无菌留取脾脏,1/5脾脏放入装有PBS的无菌培养皿中用于脾脏T淋巴细胞分离及增殖活性的检测,剩余脾脏冻存入液氮中用于脾脏组织中GSN含量及mRNA表达的测定。

1.4 检测指标
1.4.1 脾脏T淋巴细胞增殖活性

采用噻唑蓝比色法检测。将小鼠脾脏细胞悬液加入淋巴细胞分离液中,离心后吸取中层云雾状细胞团获得T淋巴细胞,台盼蓝染色检测分离细胞活性大于90%。用RPMI 1640培养基重新悬浮细胞,调整细胞浓度为2×106个/mL,接种于96孔细胞培养板,培养68 h。吸弃细胞培养上清液100 μL,加入噻唑蓝20 μL,轻轻振荡后放入细胞培养箱培养4 h。500倍倒置显微镜下观察结晶情况(细胞呈放射状结晶)。加入100 μL Triton-异丙醇溶液,轻轻振荡后放入细胞培养箱过夜。用多功能酶标仪检测540 nm波长处吸光度值,即为细胞增殖活性。

1.4.2 脾脏组织中GSN含量

取各组每只小鼠冻存脾脏组织标本50 mg,加入450 μL生理盐水,放入匀浆器中匀浆处理30 s,装入离心管中。室温下以离心半径8 cm,2 500 r/min离心10 min,吸取上清液至离心管中。ELISA法检测上清液中GSN含量,操作严格按照ELISA试剂盒说明书进行。

1.4.3 脾脏组织中GSN mRNA表达

采用实时荧光定量RT-PCR法检测。取各组每只小鼠冻存脾脏组织标本50 mg,用Trizol试剂提取总RNA,紫外可见光分光光度计测定RNA浓度,反转录合成互补DNA。GAPDH上游引物为5′-AGCAGTCCCGTACACTGGCAAAC-3′,下游引物为5′-TCTGTGGTGATGTAAATGTCCTCT-3′,大小为452 bp;GSN上游引物为5′-TGAGGTTCAAGGCAATGAGTC-3′,下游引物为5′-CCCGAGGTTGTCTTGTGAAATG-3′,大小为105 bp。按照SYBR Green荧光定量试剂盒说明书进行PCR,以GAPDH为内参照。PCR反应条件:95 ℃预变性30 s;95 ℃变性10 s、60 ℃退火与延伸20 s,共30个循环。采用Δ循环阈值(Ct)法处理结果,计算脾脏组织中GSN mRNA的相对表达量,即2-ΔΔCt

1.5 统计学处理

计量资料以±s表示,采用SPSS 22.0统计软件行析因设计方差分析、单因素方差分析、LSD检验(软件自动略去该统计量值)以及Bonferroni校正,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果
2.1 脾脏T淋巴细胞增殖活性

2组小鼠伤后0 h脾脏T淋巴细胞的增殖活性无明显差异(P>0.05),假伤组小鼠伤后8、24、48、72 h脾脏T淋巴细胞增殖活性显著高于烧伤组(P值均小于0.05)。假伤组小鼠伤后各时相点T淋巴细胞增殖活性无明显差异(P>0.05),烧伤组小鼠伤后8 h脾脏T淋巴细胞增殖活性显著低于组内伤后0、24、48、72 h(P值均小于0.05)。见表1

表1

假伤组和烧伤组小鼠各时相点脾脏T淋巴细胞增殖活性比较(±s)

表1

假伤组和烧伤组小鼠各时相点脾脏T淋巴细胞增殖活性比较(±s)

组别鼠数(只)伤后0 h伤后8 h伤后24 h伤后48 h伤后72 hFP
假伤组400.77±0.090.72±0.070.76±0.100.77±0.100.73±0.050.756>0.05
烧伤组400.73±0.07b0.12±0.04a0.56±0.07ab0.51±0.09ab0.59±0.07ab80.484<0.05

注:处理因素主效应,F=203.848,P<0.05;时间因素主效应,F=40.245,P<0.05;两者交互作用,F=30.738,P<0.05;F值、P值为组内各时相点总体比较所得;与假伤组比较,aP<0.05;与组内伤后8 h比较,bP<0.05

2.2 脾脏组织中GSN含量

2组小鼠伤后0 h脾脏组织中GSN含量无明显差异(P>0.05),假伤组小鼠伤后8、24、48、72 h脾脏组织中GSN含量显著高于烧伤组(P值均小于0.05)。假伤组小鼠伤后各时相点脾脏组织中GSN含量无明显差异(P>0.05),烧伤组小鼠伤后8 h脾脏组织中GSN含量显著低于组内伤后0、24、48、72 h(P值均小于0.05)。见表2

表2

假伤组和烧伤组小鼠各时相点脾脏组织中凝溶胶蛋白含量比较(pg/mg,±s)

表2

假伤组和烧伤组小鼠各时相点脾脏组织中凝溶胶蛋白含量比较(pg/mg,±s)

组别鼠数(只)伤后0 h伤后8 h伤后24 h伤后48 h伤后72 hFP
假伤组4045.6±6.242.8±6.148.0±4.345.5±4.346.7±4.51.083>0.05
烧伤组4037.7±2.9b11.9±2.6a19.9±4.0ab24.1±4.1ab24.6±4.0ab53.127<0.05

注:处理因素主效应,F=495.454,P<0.05;时间因素主效应,F=20.485,P<0.05;两者交互作用,F=15.459,P<0.05;F值、P值为组内各时相点总体比较所得;与假伤组比较,aP<0.05;与组内伤后8 h比较,bP<0.05

2.3 脾脏组织中GSN mRNA表达

2组小鼠伤后0 h脾脏组织中GSN mRNA表达量无明显差异(P>0.05),假伤组小鼠伤后8、24、48、72 h脾脏组织中GSN mRNA表达量显著高于烧伤组(P值均小于0.05)。假伤组小鼠伤后各时相点脾脏组织中GSN mRNA表达量无明显差异(P>0.05),烧伤组小鼠伤后8 h脾脏组织中GSN mRNA表达量显著低于组内伤后0、24、48、72 h(P值均小于0.05)。见表3

表3

假伤组和烧伤组小鼠各时相点脾脏组织中凝溶胶蛋白mRNA表达量比较(±s)

表3

假伤组和烧伤组小鼠各时相点脾脏组织中凝溶胶蛋白mRNA表达量比较(±s)

组别鼠数(只)伤后0 h伤后8 h伤后24 h伤后48 h伤后72 hFP
假伤组400.942±0.0530.899±0.0760.973±0.0840.901±0.0170.947±0.0580.413>0.05
烧伤组400.944±0.023b0.307±0.064a0.625±0.091ab0.744±0.104ab0.821±0.072ab76.135<0.05

注:处理因素主效应,F=1 530.383,P<0.05;时间因素主效应,F=57.014,P<0.05;两者交互作用,F=52.027,P<0.05;F值、P值为组内各时相点总体比较所得;与假伤组比较,aP<0.05;与组内伤后8 h比较,bP<0.05

3 讨论

GSN在肌动蛋白清除系统中发挥着重要作用[5]。有报道指出,GSN在肿瘤、遗传性疾病及脓毒症等疾病中呈低表达,可能参与了疾病的发生发展进程[6]。当机体遭受严重创伤后,血浆中GSN水平会显著下降,可能原因为细胞损伤后肌动蛋白骨架暴露,GSN与肌动蛋白的结合增加,造成血浆GSN的大量消耗;伴随GSN消耗的增加,肌动蛋白丝形成增多[7],导致进一步的组织损伤及器官功能障碍。此外,血浆GSN能结合多种炎症介质,如LPS[8]、溶血磷脂酸[9]和血小板活化因子[10],并通过其结合和灭活作用,减轻全身炎症反应状态。且GSN有助于控制糖尿病小鼠的血糖,监测GSN水平有助于糖尿病的治疗[11]。补充血浆GSN可引起循环肌动蛋白聚集物溶解增加,减轻炎症的发生与发展,显著减轻严重烧/创伤所致肺损伤或其他类型的组织损伤,提示在烧伤后全身炎症反应的病理生理过程中,血液循环系统中GSN可能对机体具有重要的保护功能。

脾脏是机体最大的免疫器官,T淋巴细胞在免疫系统中发挥着重要作用,不仅是免疫反应的效应细胞同时也是免疫反应的调节细胞,故其增殖对维持正常免疫应答具有重要意义。本研究通过观察重度烧伤后小鼠脾脏T淋巴细胞增殖活性的变化与脾脏GSN含量及mRNA表达的变化情况,初步研究了重度烧伤后GSN的变化与免疫功能变化的关系,并为GSN的最佳干预时间找到合理切入点。

本研究结果显示,烧伤组小鼠脾脏组织中GSN含量及mRNA表达量在烧伤后显著下降,这与诸多文献报道的结果[12]相一致。此外,T淋巴细胞增殖活性在烧伤后降低,伤后8 h降至最低,之后开始恢复,但始终低于正常水平,说明重度烧伤对T淋巴细胞增殖活性的影响在伤后72 h(本实验观察最长时间点)内持续存在,虽然伤后24 h后的影响程度较伤后8 h明显有所减弱,但仍显著抑制其增殖活性的恢复。这三者在伤后72 h内的变化趋势具有一致性,提示重度烧伤可以导致小鼠脾脏T淋巴细胞增殖活性、GSN含量及其mRNA表达量显著下降;且这三者均是在伤后8 h降至最低,之后逐渐回升,但始终无法恢复至假伤组小鼠水平。这一结果本身与经典的烧伤理论中关于休克的发生时间及体液渗出的变化趋势具有一致性。经典烧伤理论明确指出,重度烧伤能够引起低血容量性休克的发生,始于伤后最初数小时或10多个小时,且休克期渗出量最大的时间段为伤后8 h以内。其对临床的指导意义是,休克期的复苏治疗在伤后越早越好,伤后24 h的补液总量需在伤后8 h内完成一半的输入。此前也有研究指出严重创伤、脓毒症后补充血浆GSN有助于减轻炎症的发生和发展,并显著降低患者病死率[13],充分说明了GSN干预治疗的重要性。

结合本实验研究结果,重度烧伤可能导致小鼠免疫功能下降和GSN的大量消耗,且二者在变化趋势上有诸多共同点,均于伤后8 h降至最低。可以推断,GSN最佳干预时间应选择在伤后8 h之前,及时抑制重度烧伤对T淋巴细胞增殖活性的影响,以期恢复其免疫功能。至于具体干预剂量对小鼠重度烧伤后免疫功能和病死率的影响,还有待进一步研究。

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